РНК-интерференция
РНК-интерференция (англ. Шаблон:Lang-en2) — процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.
Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.
Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer, который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты порядка 21—25 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса RISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНК белком Argonaute либо ингибирование трансляции и/или деаденилирование мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК — siRNA и микроРНК.
Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает RNAi полезным инструментом для исследований с использованием культур клеток и живых организмов, так как синтетические двуцепочечные РНК, введённые в клетки, вызывают супрессию специфических генов. RNAi используется для крупномасштабных исследований в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии и медицины. Так, например, РНК-интерференцию используют для систематического «выключения» генов в клетках и установления функций генов при изучении деления клетки.
Исторически РНК-интерференция была известна под названием посттранскрипционного сайленсинга генов. Только после того, как эти предположительно несвязанные процессы были исследованы, стало ясно, что все они описывали проявления RNAi. В 2006 году американские учёные Эндрю Файер и Крейг Мелло получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за работы по изучению РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans<ref name="Daneholt2006">Шаблон:Cite web</ref>, опубликованные в 1998 году<ref name="Fire">Шаблон:Статья</ref>.
История
До открытия РНК-интерференции у растений были описаны факты ингибирования транскрипции антисмысловыми РНК<ref name="Ecker_1986">Шаблон:Статья</ref>. В 1990 году для того, чтобы изменить окраску цветков петунии (Petunia hybrida), в растения были введены дополнительные копии гена халконсинтазы — фермента, необходимого для синтеза розового и фиолетового пигментов. Однако повышение экспрессии гена синтазы не привело к проявлению более тёмной окраски околоцветника, напротив, цветки стали более светлыми и даже частично белыми. Полученные результаты свидетельствовали о том, что активность фермента не растёт, а снижается. Гены халконсинтазы экспрессировались на более низком уровне, чем до введения трансгена.<ref name="Napoli_1990">Шаблон:Статья</ref><ref>Шаблон:Статья</ref> Через некоторое время «подавление гена» было описано у гриба Neurospora crassa, однако данный процесс не был соотнесён с процессами, описанными для растений<ref name="Romano">Шаблон:Статья</ref>. Дальнейшие исследования показали, что у растений деградация мРНК приводит к снижению активности гена по механизму посттранскрипционного ингибирования<ref name="Van_Blokland_1994">Шаблон:Статья</ref>. Данное явление получило название «косупрессии экспрессии гена», однако механизм данного процесса не был известен<ref>Шаблон:Книга</ref>.
Подобный неожиданный эффект был описан при попытке повышения устойчивости растений к вирусам. Было известно, что растения, экспрессирующие вирусные белки, имеют повышенную устойчивость к вирусной инфекции, однако дальнейшие исследования показали, что устойчивость к инфицированию другими вирусами обеспечивается лишь короткими участками некодирующих вирусных РНК. Исследователи также полагали, что трансгенные вирусные РНК могут также ингибировать репликацию вирусов<ref name="Covey_1997">Шаблон:Статья</ref>. Обратный эксперимент, в ходе которого короткие последовательности генов растений были введены в геном вируса, показал, что происходит супрессия генов-мишеней в заражённых растениях. Данный феномен был назван «сайленсингом генов, вызванным вирусами» (англ. Шаблон:Lang-en2), а совокупность подобных явлений была названа посттранскрипционным сайленсингом генов (англ. Шаблон:Lang-en2)<ref name="Ratcliff_1997">Шаблон:Статья</ref>.
После наблюдений, сделанных на растениях, многие лаборатории по всему миру пытались обнаружить подобное явление в других организмах<ref name="Guo">Шаблон:Статья</ref><ref name="Pal-Bhadra">Шаблон:Статья</ref>. Крейг Мелло и Эндрю Файер в статье в журнале Nature в 1998 году описали эффект сайленсинга генов после введения двуцепочечной РНК в организм круглого червя Caenorhabditis elegans<ref name="Fire" />. В исследованиях по регуляции синтеза мышечных белков Мелло и Файера показали, что введение мРНК или антисмысловых РНК не влияло на синтез белка, в то время как введение двуцепочечных РНК успешно снижало экспрессию гена-мишени. Результатом этих работ стало появление термина РНК-интерференция. Исследования Файера и Мелло примечательны тем, что в ходе их работы было выявлено действующее начало системы посттранскрипционного сайленсинга генов. В 2006 году за исследования в области РНК-интерференции Файер и Мелло получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины<ref name="Daneholt2006" />.
Компоненты
Рибонуклеиновый компонент системы РНК-интерференции может быть представлен эндогенными и экзогенными короткими двуцепочечными олигонуклеотидами двух типов — микроРНК и малыми интерферирующими РНК (англ. Шаблон:Lang-en2).
Малые интерферирующие РНК
Шаблон:Main Малые интерферирующие РНК представляют собой двуцепочечные РНК длиной 21—25 нуклеотидов с двумя неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'-концах. Каждая цепочка нуклеотидов имеет фосфатную группу на 5'-конце и гидроксильную группу на 3'-конце. Такая структура siRNA образуется в результате активности фермента Dicer, субстратом которого являются длинные двуцепочечные РНК или короткие РНК, содержащие шпильки<ref name="Bernstein"/>. Дуплексы малых интерферирующих РНК поступают далее в каталитический комплекс RISC, где при участии белка Argonaute происходит расплетение дуплекса и образование комплементарного комплекса короткой антисмысловой РНК со специфической последовательностью в кодирующей области мРНК, что приводит к дальнейшей деградации последней. В отличие от микроРНК, малые интерферирующие РНК, как правило, точно спариваются с мишенью и приводят к эндонуклеолитическому расщеплению единственной специфической мРНК<ref name="Pillai_2006">Шаблон:Статья</ref>
МикроРНК
Шаблон:Main МикроРНК (англ. Шаблон:Lang-en2) представляют собой некодирующие РНК длиной 21—22 нуклеотида, принимающие участие в регуляции экспрессии генов. МикроРНК связываются со специфическими последовательностями мРНК в 3'-нетранслируемой области и вызывают ингибирование трансляции либо удаление поли(А)-хвоста. Молекулы микроРНК экспрессируются в виде первичных транскриптов длинных генов, кодирующих предшественники микроРНК (англ. Шаблон:Lang-en2), и после процессинга в ядре клетки представляют собой pre-miRNA — структуры вида стебелёк-петля длиной около 70 нуклеотидов. Комплекс процессинга pri-miRNA в pre-miRNA содержит фермент с активностью РНКазы III, называемый Drosha, и белок, связывающий двуцепочечную РНК, — Pasha. Двуцепочечная часть pre-miRNA связывается и разрезается белком Dicer (у Drosophila melanogaster микроРНК и малые интерферирующие РНК процессируются разными изоформами фермента Dicer<ref name="Lee">Шаблон:Статья</ref>); при этом образуется зрелая молекула микроРНК, которая может далее поступать в RISC<ref name="Denli">Шаблон:Статья</ref><ref>Шаблон:Статья</ref><ref>Шаблон:Статья</ref>. Известен также путь образования микроРНК, независимый от Dicer. Процессинг предшественника микроРНК в данном случае осуществляется белком Argonaute 2<ref>Cifuentes D, Xue H, Taylor DW, Patnode H, Mishima Y, Cheloufi S, Ma E, Mane S, Hannon GJ, Lawson N, Wolfe S, Giraldez AJ. (2010) «A Novel miRNA Processing Pathway Independent of Dicer Requires Argonaute2 Catalytic Activity.» Science (Published Online May 6, 2010) doi:10.1126/science.1190809</ref><ref name="nature09092">Шаблон:Статья</ref>.
У животных микроРНК обычно имеют неполное спаривание с мРНК-мишенью и могут ингибировать трансляцию многих мРНК со сходными последовательностями. У растений спаривание во многих случаях может быть полным.
RISC
Каталитической частью RISC (комплекс сайленсинга, индуцированный РНК англ. Шаблон:Lang-en2) являются белки-эндонуклеазы семейства Argonaute, которые разрезают мРНК, комплементарные связанной малой интерферирующей РНК<ref name="Daneholt2006"/>. Так как фрагменты, которые образуются после разрезания белком Dicer являются двуцепочечными, потенциально каждая из цепочек может являться малой интерферирующей РНК (англ. Шаблон:Lang-en2). Однако, лишь одна из двух цепочек, называемая ведущей цепочкой (англ. Шаблон:Lang-en2) связывается с белком Argonaute и подавляет экспрессию гена. Другая цепочка, называемая цепочкой-спутницей (англ. Шаблон:Lang-en2) подвергается деградации во время активации RISC<ref name="Gregory">Шаблон:Статья</ref>. Хотя ранее считалось, что цепочки разделяет АТФ-зависимая геликаза<ref name="Lodish">Шаблон:Книга</ref>, в настоящее время показано, что данный процесс является АТФ-независимым и осуществляется непосредственно белками, входящими в состав RISC<ref name="Matranga">Шаблон:Статья</ref><ref name="Leuschner">Шаблон:Статья</ref>. Выбор направляющей цепочки не зависит от направления, в котором Dicer разрезает двуцепочечную РНК до поступления в RISC<ref>Шаблон:Статья</ref><ref name="Preall">Шаблон:Статья</ref>. Белок R2D2 может являться фактором, различающим при связывании более стабильный 5'-конец цепочки-спутницы<ref name="Tomari">Шаблон:Статья</ref>.
При помощи рентгеноструктурного анализа изучено связывание молекул РНК с РНК-связывающим доменом белка семейства Argonaute. При этом фосфорилированный 5'-конец одноцепочечной РНК попадает в консервативный карман белка, где 5'-концевой фосфат удерживается координационными связями при участии иона Mg2+, а адениновый остаток вступает в стекинг-взаимодействия с консервативным остатком тирозина. Данный участок белка, по-видимому, стимулирует связывание малых интерферирующих РНК с мишенью мРНК<ref name="Ma">Шаблон:Статья</ref>.
К настоящему времени механизм, по которому RISC находит комплементарную мРНК внутри клетки, изучен недостаточно. Показано, что для успешной деградации мРНК комплексом siRISC трансляция не требуется<ref name="Sen">Шаблон:Статья</ref>. Более того, показано, что путь РНК-интерференции может быть более эффективным против мРНК-мишеней, трансляция которых не осуществляется в текущий момент времени<ref name="Gu">Шаблон:Статья</ref>. Белки семейства Argonaute являются каталитическим компонентом RISC, и находятся в специфических районах цитоплазмы, известных как Р-тельца (англ. Шаблон:Lang-en2)<ref name="SenBlau">Шаблон:Статья</ref>; показано, что активность малых интерферирующих РНК и деградация мРНК максимальны именно в Р-тельцах<ref name="Lian">Шаблон:Статья</ref>. Р-тельца являются важной частью системы РНК-интерференции. Их разрушение приводит к снижению эффективности данного процесса.<ref name="Jakymiw">Шаблон:Статья</ref>.
Механизм
РНК-интерференция является РНК-зависимым процессом сайленсинга генов, который контролируется RISC. RISC активируется в цитоплазме клетки, где короткие двуцепочечные молекулы РНК взаимодействуют с каталитическим компонентом RISC — белком Argonaute<ref name="Daneholt2006"/>. В случае, когда двуцепочечная РНК является экзогенной (появляется в результате лабораторных манипуляций или инфицирования РНК-содержащим вирусом), РНК оказывается непосредственно в цитоплазме, где разрезается на короткие фрагменты (siRNA) белком Dicer, и образующийся siRNA-содержащий функциональный комплекс называется siRISC. В случае пре-микроРНК, экспрессирующихся с генов некодирующих РНК, RNAi запускается эндогенной двуцепочечной РНК. Первичные транскрипты таких генов сначала процессируются в ядре с образованием пре-микроРНК, содержащих специфические структуры «стебель-петля». Пре-микроРНК затем экспортируются в цитоплазму и разрезаются белком Dicer с образованием микроРНК, которые включаются в состав микроРНК-содержащего комплекса, называемого miRISC. Таким образом, RISC является местом, где пересекаются два пути РНК-интерференции, индуцированные экзогенными и эндогенными двуцепочечными РНК<ref name="pmid15614608">Шаблон:Статья</ref>.
Разрезание двуцепочечных РНК
Экзогенная двуцепочечная РНК запускает систему РНК-интерференции, активируя фермент-рибонуклеазу Dicer<ref name="Bernstein">Шаблон:Статья</ref>, который связывает и разрезает РНК-дуплексы, при этом образуются siRNA-двуцепочечные фрагменты длиной 21—25 пар нуклеотидов, с несколькими неспаренными основаниями на каждом конце<ref>Шаблон:Статья</ref><ref name="Zamore">Шаблон:Статья</ref><ref name="Vermeulen">Шаблон:Статья</ref><ref>Шаблон:Статья</ref>. Биоинформационный анализ геномов многих организмов предполагает, что такая длина siRNA увеличивает их специфичность к гену-мишени и снижает вероятность неспецифического связывания<ref name="Qiu">Шаблон:Статья</ref>. Далее siRNA разделяются на отдельные цепочки и вовлекаются в RISC (siRISC). После интеграции в RISC, siRNA комплементарно соединяются с мРНК-мишенью и вызывают разрезание мРНК, таким образом предотвращая её трансляцию<ref>Шаблон:Статья</ref>.
Экзогенная двуцепочечная РНК узнаётся и связывается специальными эффекторными белками (например, RDE-4 у Caenorhabditis elegans и R2D2 у Drosophila), усиливающими активность белка Dicer<ref name="Parker">Шаблон:Статья</ref>. Эти эффекторные белки связываются лишь с длинными двуцепочечными РНК, однако механизм сродства к таким субстратам неизвестен<ref name="Parker"/>. Такие РНК-связывающие белки облегчают перенос разрезанных siRNA к комплексу RISC<ref name="Liu2003">Шаблон:Статья</ref>.
У Caenorhabditis elegans путь инициации РНК-интерференции в клетке может быть усилен в результате синтеза «вторичных» siRNA на матрице «первичных» малых интерферирующих РНК<ref>Шаблон:Статья</ref>. «Вторичные» siRNA отличаются по структуре от образовавшихся в результате активности белка Dicer, и, по-видимому, синтезируются РНК-зависимой РНК-полимеразой (англ. Шаблон:Lang-en2)<ref name="Pak">Шаблон:Статья</ref><ref name="Sijen">Шаблон:Статья</ref>.
Сайленсинг транскрипции
Многие эукариоты используют систему РНК-интерференции для поддержания структуры генома. Химическая модификация гистонов и переход соответствующих участков хромосом в состояние гетерохроматина приводит к снижению транскрипции соответствующих генов<ref name="Holmquist_2006">Шаблон:Статья</ref>; данный процесс относится к сайленсингу транскрипции, индуцированному РНК (англ. Шаблон:Lang-en2), и осуществляется сложным комплексом белков. В делящихся дрожжах данный комплекс содержит Argonaute, белок с хромодоменом Chp1, и белок, называемый Tas3 с неизвестной функцией<ref name="Verdel">Шаблон:Статья</ref>. Как следствие, индукция и расширение гетерохроматиновых участков требует наличия белков Argonaute и РНК-зависимой РНК-полимеразы<ref name="Irvine">Шаблон:Статья</ref>. В действительности, делеции данных генов в делящихся дрожжах Schizosaccharomyces pombe нарушает метилирование гистонов и образование центромер<ref name="Volpe_2002">Шаблон:Статья</ref>, вызывает замедление или остановку анафазы в процессе деления клетки<ref name="Volpe_2003">Шаблон:Статья</ref>. В некоторых случаях подобные процессы связаны с модификацией гистонов и для них показан эффект повышения транскрипции соответствующих генов<ref name="Li">Li LC, Okino ST, Zhao H, Pookot D, Place RF, Urakami S, Enokida H, Dahiya R. (2006). Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proc Natl Acad Sci USA 103(46):17337–42. PMID 17085592</ref>.
Механизм, по которому комплекс RITS вызывает образование гетерохроматина, изучен не полностью. Значительная часть исследований направлена на изучение участка генома дрожжей, регулирующего тип спаривания (англ. Шаблон:Lang-en2), однако данный участок может быть нерепрезентативным в случае геномов других организмов. Для сохранения существующих районов гетерохроматина RITS образует комплексы с малыми интерферирующими РНК, комплементарными соответствующим генам и прочно связывается с метилированными гистонами. Далее RITS действует в момент транскрипции, деградируя любые пре-мРНК, синтезируемые РНК-полимеразой. Для образования подобных участков гетерохроматина требуется фермент Dicer, который синтезирует первичные комплементарные siRNA, участвующие в деградации транскриптов<ref name="Noma">Шаблон:Статья</ref>. Поддержание участков хромосом в состоянии гетерохроматина, по-видимому, является примером положительной обратной связи, так как малые интерферирующие РНК, входящие в состав RITS, образуются из случайных транскриптов, синтезированных РНК-зависимой РНК-полимеразой<ref name="Sugiyama">Шаблон:Статья</ref>. Данные, полученные при исследовании центромерных районов хромосом дрожжей, вероятно, не могут быть распространены на млекопитающих, так как у последних поддержание гетерохроматиновых участков не всегда зависит от системы РНК-интерференции<ref name="Wang_2006">Шаблон:Статья</ref>.
Связь с редактированием РНК
Наиболее распространённой формой редактирования РНК у высших эукариот является превращение аденозина в инозин в двуцепочечных РНК, которое осуществляется ферментом аденозиндеаминазой<ref name="Bass_2002">Шаблон:Статья</ref>. В 2000 году было предположено что путь РНК-интерференции и путь редактирования РНК A→I могут конкурировать за общий субстрат двуцепочечной РНК<ref name="Bass_2000">Шаблон:Статья</ref>. Действительно, некоторые предшественники малых интерферирующих РНК могут подвергаться редактированию A→I<ref name="Luciano_2004">Шаблон:Статья</ref><ref name="yang2006">Шаблон:Статья</ref>, причём данный механизм может регулировать процессинг и экспрессию зрелых молекул малых интерферирующих РНК<ref name="yang2006" /> У млекопитающих описан как минимум один фермент, выводящий молекулы малых интерферирующих РНК из системы РНК-интерференции.<ref name="Yang_2005">Шаблон:Статья</ref>. Исследования линий круглого червя Caenorhabditis elegans, не имеющих фермента редактирования РНК A→I, показали, что редактирование РНК может препятствовать сайленсингу эндогенных генов и трансгенов по пути РНК-интерференции<ref name="Nishikura_2006">Шаблон:Статья</ref>.
Различия между организмами
Организмы отличаются по способности воспринимать чужеродные двуцепочечные РНК и использовать их в процессе РНК-интерференции. Эффекты РНК-интерференции у растений и Caenorhabditis elegans (но не у дрозофилы и млекопитающих) могут наследоваться, а могут быть системными. У растений система РНК-интерференции может распространять малые интерферирующие РНК по плазмодесмам (каналам в клеточных стенках, осуществляющих коммуникацию и транспорт)<ref name="Lodish" />. Наследование обеспечивается метилированием промоторов, изменённый паттерн метилирования передаётся в результате деления дочерним клеткам<ref>Шаблон:Статья</ref>. Значительные отличия в мишенях малых интерферирующих РНК между растениями и животными обусловлены тем, что у растений микроРНК высоко комплементарны рибонуклеиновым мишеням и вызывают деградацию мРНК в составе RISC, а у животных малые интерферирующие РНК сильно отличаются по последовательности нуклеотидов и вызывают репрессию трансляции<ref name="Saumet" />. МикроРНК могут оказывать влияние на инициацию трансляции путём взаимодействия с факторами инициации трансляции и с поли(А)-трактом мРНК<ref name="Humphreys">Шаблон:Статья</ref>.
Некоторые простейшие, например, Leishmania major и Trypanosoma cruzi, не имеют никаких компонентов пути РНК-интерференции<ref name="DaRocha_2004">Шаблон:Статья</ref><ref name="Robinson_2003">Шаблон:Статья</ref>. Большая часть компонентов системы РНК-интерференции также отсутствует у некоторых грибов, например, у модельного организма Saccharomyces cerevisiae<ref name="Aravind">Шаблон:Статья</ref>. Показано наличие компонентов системы РНК-интерференции в других делящихся дрожжах, например, Saccharomyces castellii и Candida albicans. Индукция двух белков системы РНК-интерференции из Saccharomyces castellii облегчает данный процесс у Saccharomyces cerevisiae<ref>Шаблон:Статья</ref>. Тот факт, что некоторые аскомицеты и базидиомицеты не имеют пути РНК-интерференции, указывает на то, что гены, кодирующие белки, необходимые для данного процесса, были утеряны независимо во многих родословных грибов, вероятно, по причине появления в ходе эволюции нового пути со сходными функциями, или ввиду утери адаптивного преимущества в данных экологических нишах<ref name="Nakayashiki">Шаблон:Статья</ref>.
Аналоги RNAi у прокариот
Экспрессия генов у прокариот регулируется системой, основанной на РНК, сходной по некоторым параметрам с системой РНК-интерференции. У прокариот описаны гены, кодирующие специальные РНК, которые контролируют распространение и трансляцию мРНК, путём спаривания с комплементарными последовательностями. Однако, данные регуляторные РНК не являются полными аналогами малым интерферирующим РНК, так как в данный процесс не вовлекается фермент Dicer<ref name="Morita_2006">Шаблон:Статья</ref>. Показано, что у прокариот система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) является аналогичной системе РНК-интерференции у эукариот, хотя ни для одного из компонентов прокариотической системы не известны гомологичные эукариотические белки<ref name="makarova">Шаблон:Статья</ref>.
Биологические функции
Иммунитет
Система РНК-интерференции является важной частью иммунного ответа к вирусам и к другому чужеродному генетическому материалу. У растений система РНК-интерференции предотвращает распространение транспозонов<ref name="Stram_2006">Шаблон:Статья</ref>. Растения имеют несколько гомологов белка Dicer, которые направлены против различных типов вирусов<ref name="Blevins">Шаблон:Статья</ref>. Показано, что индуцированный сайленсинг генов у растений может передаваться от подвоя к прививаемому растению<ref name="Palauqui">Шаблон:Статья</ref>. Эта особенность адаптивной иммунной системы растений позволяет после первоначального локального проникновения вируса отвечать на повторные проникновения вируса всему организму<ref name="Voinnet">Шаблон:Статья</ref>. В ответ многие вирусы в ходе эволюции приобрели механизмы, подавляющие систему РНК-интерференции в клетках растений<ref name="Lucy">Шаблон:Статья</ref>. Описаны вирусные белки, связывающие короткие двуцепочечные фрагменты РНК с одноцепочечными выступами, образующиеся в результате активности белка Dicer<ref name="Merai">Шаблон:Статья</ref>. Некоторые растения экспрессируют эндогенные малые интерферирующие РНК в ответ на заражение некоторыми бактериями<ref name="Katiyar-Agarwal">Шаблон:Статья</ref>. Эти эффекты могут быть частью общего ответа на патогены, в результате которого в организме хозяина снижаются многие метаболические процессы в ответ на инфекцию<ref name="Fritz">Шаблон:Статья</ref>.
Хотя в клетках животных, как правило, экспрессируется меньшее количество вариантов фермента Dicer, чем у растений, система РНК-интерференции у животных в некоторых случаях участвует в антивирусном ответе. РНК-интерференция у ювенильных и взрослых особей Drosophila играет важную роль во врождённом противовирусном иммунитете и принимает участие в защите против таких патогенов, как Шаблон:Не переведено 3<ref name="Zambon">Шаблон:Статья</ref><ref name="Wang">Шаблон:Статья</ref>. Сходную роль в иммунитете играет система РНК-интерференции у Caenorhabditis elegans: экспрессия белков Argonaute повышается при вирусной инфекции, при этом черви, в организме которых повышается экспрессия генов пути РНК-интерференции, приобретают устойчивость к вирусной инфекции<ref name="Lu">Шаблон:Статья</ref><ref name="Wilkins">Шаблон:Статья</ref>.
Роль системы РНК-интерференции во врождённом иммунитете млекопитающих изучена не полностью. Однако тот факт, что некоторые вирусы содержат гены, снижающие ответ системы РНК-интерференции в клетках млекопитающих, свидетельствуют о наличии иммунного ответа, вызванного системой РНК-интерференции<ref name="Berkhout">Шаблон:Статья</ref><ref name="Schutz">Шаблон:Статья</ref>. Однако, гипотеза иммунитета, опосредованного системой РНК-интерференции у млекопитающих, является недостаточно обоснованной<ref name="Cullen">Шаблон:Статья</ref>. Хотя недавно Майяр и соавт.<ref>P. V. Maillard, C. Ciaudo, A. Marchais, Y. Li, F. Jay, S. W. Ding, and Olivier Voinnet (2013) Antiviral RNA Interference in Mammalian Cells. Science,342(6155), 235-238 DOI: 10.1126/science.1241930</ref> и Ли и соавт.<ref>Yang Li, Jinfeng Lu, Yanhong Han, Xiaoxu Fan, and Shou-Wei Ding (2013) RNA Interference Functions as an Antiviral Immunity Mechanism in Mammals. Science,342(6155), 231-234 DOI: 10.1126/science.1241911</ref> представили новые свидетельства существования в клетках млекопитающих функционального противовирусного пути РНК-интерференции. Малые интерферирующие РНК, экспрессируемые вирусом герпеса, могут вызывать образование гетерохроматина и приводить к переходу вируса в латентное состояние<ref name="autogenerated2">Шаблон:Статья</ref>.
Показано, что удаление одной копии гена Dicer1 у мышей приводило к появлению большего количество опухолей, чем в контрольной группе, также понижались уровни микроРНК и выживаемость. Полное удаление гена Dicer1 блокировало образование опухолей, вероятно, также и потому, что некоторый уровень экспрессии продукта гена Dicer1 требуется для роста клеток<ref>Шаблон:Статья</ref>.
В работах 2013 года показано, что в клетках млекопитающих имеется система РНК-интерференции, проявляющая противовирусную активность.<ref>P. V. Maillard, C. Ciaudo, A. Marchais, Y. Li, F. Jay, S. W. Ding, and Olivier Voinnet (2013) Antiviral RNA Interference in Mammalian Cells. Science , 342(6155), 235—238 Шаблон:DOI</ref><ref>Yang Li, Jinfeng Lu, Yanhong Han, Xiaoxu Fan, and Shou-Wei Ding (2013) RNA Interference Functions as an Antiviral Immunity Mechanism in Mammals" Science342(6155), 231—234 Шаблон:DOI</ref> Другие функции системы РНК-интерференции вирусов млекопитающих представлены микроРНК вируса простого герпеса, которые действуют как организаторы гетерохроматина и приводят к латентности вируса.<ref name="autogenerated3">Шаблон:Статья</ref>
Экспрессия генов
При репрессии трансляции<ref name="Saumet" />, на некоторых этапах развития живых организмов, особенно на стадии морфогенеза и поддержания клеток в недифференцированном состоянии (например, в случае стволовых клеток), важное значение имеют эндогенно экспрессируемые микроРНК, которые являются продуктами интронных и межгенных участков<ref name="Carrington">Шаблон:Статья</ref>. Роль таких эндогенно экспрессируемых микроРНК в подавлении экспрессии генов была впервые описана у нематоды Caenorhabditis elegans в 1993 году<ref name="Lee_1993">Шаблон:Статья</ref>. У растений такая функция микроРНК была впервые описана на модельном объекте Arabidopsis thaliana, для которого было показано влияние "JAW микроРНК" на регуляцию нескольких генов, контролирующих внешний вид<ref name="Palatnik_2003">Шаблон:Статья</ref>. У растений гены, регулируемые микроРНК, как правило, являются факторами транскрипции<ref name="Zhang_plant">Шаблон:Статья</ref>, поэтому микроРНК регулируют целые генные сети, изменяя экспрессию ключевых генов (в том числе, факторов транскрипции и белков F-box) в ходе эмбрионального развития<ref name="Jones-Rhoades">Шаблон:Статья</ref>. У многих организмов, в том числе и у человека, микроРНК принимают участие в образовании опухолей и нарушении регуляции клеточного цикла. В данном случае микроРНК могут являться как онкогенами, так и супрессорами опухолей<ref name="Zhang_cancer">Шаблон:Статья</ref>.
Последовательности малых интерферирующих РНК и микроРНК комплементарны последовательностям нуклеотидов промоторных участков. Связывание siRNA и микроРНК с этими участками может приводить к повышению транскрипции генов и активации РНК. Увеличение экспрессии данных генов происходит при участии белков Dicer и Argonaute, также происходит деметилирование гистонов<ref>Шаблон:Статья</ref><ref>Шаблон:Статья</ref>.
Эволюция
Методы вычислительного филогенетического анализа свидетельствуют о том, что наиболее поздний общий предок всех эукариот имел РНК-интерференцию, отсутствие же системы РНК-интерференции у некоторых эукариот является приобретённым признаком<ref name="Cerutti">Шаблон:Статья</ref>. Эволюционно древний путь РНК-интерференции, по-видимому, содержал ферменты, аналогичные Dicer, Argonaute, PIWI, а также РНК-зависимую РНК-полимеразу. Вероятно, наряду с РНК-интерференцией, эти ферменты играли в клетке и другие роли. Масштабные исследования в области сравнительной геномики свидетельствуют о том, что малая группа, ставшая родоначальником всех эукариот также имела компоненты, тесно связанные с системами деградации ДНК, например, сходные с экзосомными комплексами<ref name="Anantharaman">Шаблон:Статья</ref>. Семейство белков Argonaute, общее для многих эукариот, а также архей и некоторых бактерий (например, Aquifex aeolicus), гомологично и эволюционно происходит от компонентов системы инициации трансляции<ref name="Anantharaman" />.
Наиболее древней функцией системы РНК-интерференции, как правило, называют защиту от экзогенных генетических элементов — геномов вирусов и транспозонов<ref name="Cerutti" /><ref name="Buchon">Шаблон:Статья</ref>. Некоторые связанные функции, например, модификация гистонов, могли быть представлены у предков современных эукариот, в то время как другие — например, регуляция развития при помощи микроРНК, по-видимому, появились позже<ref name="Cerutti" />.
Гены системы РНК-интерференции у многих эукариот являются компонентами врождённой иммунной системы, противостоящей вирусам. Некоторые вирусы растений приобрели механизмы подавления ответа системы РНК-интерференции клетки хозяина<ref name="Lucy" />. Скорость изменения генов пути РНК-интерференции у Drosophila направляется положительным отбором. Гены системы РНК-интерференции эволюционируют с очень высокой скоростью в сравнении с другими генами генома дрозофилы<ref name="Obbard">Шаблон:Статья</ref>.
Применение
.jpg){kind=link}
Выключение генов
Система РНК-интерференции часто используется в экспериментальной биологии для изучения функции генов в культурах клеток и в модельных организмах in vivo<ref name="Daneholt2006"/>. Синтетическую двуцепочечную РНК, комплементарную заданному гену, вводят в клетку или организм, где чужеродная молекула РНК запускает систему РНК-интерференции. Этот метод позволяет исследователям значительно снижать уровень экспрессии соответствующего гена. Изучение последствий снижения экспрессии интересующего гена позволяет выяснить физиологическую роль продукта данного гена-мишени. Так как система РНК-интерференции не может полностью выключить экспрессию гена, данный метод называется «нокдауном гена» — в отличие от полного удаления гена, «нокаута гена»<ref name="pmid12480342">Шаблон:Статья</ref>.
Значительные достижения в области вычислительной биологии позволяют разрабатывать двуцепочечные РНК, которые обеспечивают максимальное снижение экспрессии гена-мишени и обладают минимальными побочными эффектами. Побочные эффекты могут возникать в случае, когда вводимая молекула РНК имеет последовательность, комплементарную нескольким генам одновременно, что приводит к снижению экспрессии нескольких генов на недостаточную величину. Подобные трудности возникают часто в случае, когда двуцепочечная РНК содержит повторяющиеся последовательности. Изучение геномов Homo sapiens, Caenorhabditis elegans, и Schizosaccharomyces pombe показало, что около 10 % молекул малых интерферирующих РНК будут приводить к значительным побочным эффектам<ref name="Qiu" /> Разработано значительное количество компьютерных программ для подбора последовательностей малых интерферирующих РНК<ref name="Naito_ds">Шаблон:Статья</ref><ref name="Henschel">Шаблон:Статья</ref>, в том числе, специфичных для млекопитающих<ref name="Naito_si">Шаблон:Статья</ref> и вирусов<ref name="Naito_virus">Шаблон:Статья</ref>. Предлагаемые последовательности siRNA автоматически проверяются на перекрёстную активность.
В зависимости от организма и экспериментальной системы, экзогенные РНК могут быть сконструированы длинными и являться мишенью белка Dicer, либо короткими и являться субстратами малых интерферирующих РНК. Для большинства клеток млекопитающих предпочтительнее использовать более короткие РНК, так как длинные двуцепочечные РНК у млекопитающих вызывают интерфероновый ответ, форму врождённого иммунитета, неспецифической реакции на чужеродный генетический материал<ref name="Reynolds">Шаблон:Статья</ref>. Для ооцитов мыши, а также для клеток эмбрионов мыши на ранних стадиях развития интерфероновый ответ на экзогенные двуцепочечные РНК не характерен, поэтому эти клетки являются удобной системой изучения нокдауна генов у млекопитающих<ref name="Stein_oocyte">Шаблон:Статья</ref>. Для использования системы РНК-интерференции в лабораторных условиях были разработаны специальные методы, не требующие прямого введения малых интерферирующих РНК в клетку, например, системы трансфекции плазмидой, кодирующие транскрибируемые последовательности siRNA<ref name="Brummelkamp">Шаблон:Статья</ref>, лентивирусные векторы, позволяющие индуцировать или инактивировать транскрипцию, называемые также англ. Шаблон:Lang-en2<ref name="Tiscornia">Шаблон:Статья</ref><ref name="Ventura">Шаблон:Статья</ref>.
Стратегию искусственной регуляции генов альтернативную РНК-интерференции обеспечивает метод CRISPRi действующий на уровне включения/выключения транскрипции<ref>Gilbert, L. A., Larson, M. H., Morsut, L., et al. & Qi, L. S. (2013) CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell, 154(2), 442-451 doi: 10.1016/j.cell.2013.06.044</ref>
Функциональная геномика
Методы функциональной геномики, использующие систему РНК-интерференции применяют обычно на Caenorhabditis elegans<ref name="Kamath">Шаблон:Статья</ref> и Drosophila melanogaster<ref name="Boutros">Шаблон:Статья</ref>, так как данные животные являются наиболее часто используемыми моделями и система RNAi в этих организмах работает наиболее эффективно. Caenorhabditis elegans является удобным объектом для исследований при помощи РНК-интерференции по двум причинам — во-первых, эффекты сайленсинга генов у нематоды наследуются, и, во-вторых, потому что доставка двуцепочечной ДНК в нематоду чрезвычайно проста. Нематодам можно скармливать клетки бактерий, например, Escherichia coli, содержащие требуемые двуцепочечные РНК, которые при этом усваиваются через кишечник. Данный способ доставки РНК с пищей является эффективным с точки зрения эффективности сайленсинга генов и одновременно намного более дешёвым, простым и быстрым, чем обмакивание червей в раствор, содержащий двуцепочечные РНК или введение двуцепочечных РНК в гонады<ref name="Fortunato_2005">Шаблон:Статья</ref>. У большинства других организмов доставка двуцепочечных РНК представляется намного более трудоёмкой, однако принимаются попытки крупномасштабного исследования геномов в культурах клеток млекопитающих<ref name="Cullen_genome">Шаблон:Статья</ref>.
Подходы к созданию библиотек РНК-интерференции для полных геномов намного сложнее, чем в случае определённого набора малых интерферирующих РНК для заданного эксперимента. Для создания библиотек siRNA, а также прогнозирования их эффективности для нокдауна генов, часто применяют искусственные нейронные сети<ref name="Huesken">Шаблон:Статья</ref><ref name="Ge">Шаблон:Статья</ref>. Массовые скрининги геномов являются многообещающими методиками для аннотации геномов, что привело к развитию методов высокопроизводительного скринирования на основе технологии ДНК-микрочипов<ref name="Janitz">Шаблон:Статья</ref><ref name="Vanhecke">Шаблон:Статья</ref>. Под вопросом остаётся возможность использования данных методик для исследования других организмов, — например, паразитических круглых червей<ref name="Geldhof">Шаблон:Статья</ref><ref name="Geldhof2">Шаблон:Статья</ref>.
Исследования в области функциональной геномики с использованием методов РНК-интерференции, являются привлекательными для картирования геномов и аннотации генов у растений, так как многие растения являются полиплоидами, что затрудняет исследования при помощи традиционных методов генетической инженерии. Например, РНК-интерференция успешно используется в функциональной геномике для изучения Triticum aestivum (гексаплоид)<ref name="Travella">Шаблон:Статья</ref>, а также и в случае других модельных растений — Arabidopsis thaliana и кукурузы<ref name="McGinnis">Шаблон:Статья</ref>.
Медицина
Возможно применение методов РНК-интерференции в терапии, в частности в РНК-терапии. Хотя введение длинных двуцепочечных РНК в клетки млекопитающих затруднено из-за интерферонового ответа, успешно используются молекулы, подобные малым интерферирующим РНК<ref name="Paddison">Шаблон:Статья</ref>. Были произведены клинические испытания терапии деградации сетчатки и лечения респираторного синцитиального вируса при помощи РНК-интерференции<ref name="Sah">Шаблон:Статья</ref>, также была показана эффективность системы RNAi для терапии повреждений печени на лабораторных мышах<ref name="Zender">Шаблон:Статья</ref>.
Другим возможным клиническим применением РНК-интерференции является лечение вируса простого герпеса типа 2 (например, в Harvard University Medical School) и ингибирование экспрессии генов вирусов в опухолевых клетках<ref name="Jiang">Шаблон:Статья</ref>, нокдаун рецепторов хозяина к ВИЧ и корецепторов<ref>Шаблон:Статья</ref>, сайленсинг генов гепатита A<ref name="Kusov">Шаблон:Статья</ref> и гепатита B<ref name="Jia">Шаблон:Статья</ref>, сайленсинг генов вируса гриппа<ref name="autogenerated1">Шаблон:Статья</ref>, ингибирование репликации вируса кори<ref name="Hu">Шаблон:Статья</ref>. Также возможно лечение нейродегенеративных заболеваний, например, болезни Хантингтона<ref name="Raoul">Шаблон:Статья</ref>. РНК-интерференцию также часто считают многообещающим способом лечения опухолей путём выключения генов, повышенно экспрессирующихся в клетках опухолей, либо генов, принимающих участие в делении клетки<ref name="Putral">Шаблон:Статья</ref><ref name="Izquierdo">Шаблон:Статья</ref>. Важной областью исследований в области РНК-интерференции для клинического применения является разработка методов безопасной доставки малых РНК, например, подбор векторных систем, для терапии генами<ref name="Li_delivery">Шаблон:Статья</ref><ref name="Takeshita">Шаблон:Статья</ref>.
Несмотря на то, что появляются новые исследования на культурах клеток, подтверждающие потенциальную возможность терапии лекарствами на основе компонентов системы РНК-интерференции, остаются нерешёнными вопросы относительно безопасности таких методов лечения, в том числе, неочевидны последствия от побочных эффектов репрессии генов со сходными нуклеотидным последовательностями<ref name="Tong">Шаблон:Статья</ref>. Методы вычислительной геномики показывают, что подобные побочные эффекты ошибочного связывания составляют до 10%<ref name="Qiu" />. Одно из крупных исследований заболеваний печени на мышах, показало более высокий уровень смертности среди экспериментальных животных, что было объяснено исследователями «перегрузкой» двуцепочечными РНК (miRNA, shRNA)<ref name="Grimm">Шаблон:Статья</ref>, так как малые РНК, содержащие шпильку процессируются в ядре и экспортируются в цитоплазму по механизму активного транспорта. Все рассмотренные факты исследуются и в настоящее время, что ограничивает потенциальные приложения методов РНК-интерференции для терапии.
Кроме того существенным препятствием в развитии методов терапии с помощью РНК-интерференции является то, что доставка малых интерферирующих (миРНК) пока крайне неэффективна, и чрезвычайно высокие дозы препарата необходимы для достижения даже минимально значимого нокдауна гена-мишени. Однако разработанные в последнее время технологии позволяют надеяться, что в скором времени этот способ терапии все же войдёт и в клиническую практику. Так, например, обнаружено, что одновременная инъекция миРНК связанной с холестерином (chol-siRNA) и, обладающего эндосомолитическими свойствами, полимера ARC-520 позволила добиться более чем более 500-кратного повышения эффективности и достигнуть 90% снижения экспрессии гена-мишени у мышей in vivo.<ref>So C. Wong, Jason J. Klein, Holly L. Hamilton et al. and David L. Lewis.(2012) Co-Injection of a Targeted, Reversibly Masked Endosomolytic Polymer Dramatically Improves the Efficacy of Cholesterol-Conjugated Small Interfering RNAs In Vivo. Nucleic Acid Therapeutics., 22(6): 380-390. doi:10.1089/nat.2012.0389</ref>.
Разрабатываются способы использования РНК-интерференции для лечения персистирующей ВИЧ-инфекции первого типа. Вирусы, подобные ВИЧ-1 представляют собой сложную мишень для системы RNAi, так как требуют сочетания нескольких путей РНК-интерференции. Возможные способы антивирусной терапии при помощи системы РНК-интерференции представляются многообещающими, но крайне важным представляется также постановка многих контрольных экспериментов в доклинических испытаниях для того, чтобы однозначно показать сиквенс-специфичное действие системы RNAi<ref name="Berkhout1">Шаблон:Книга</ref>.
Биотехнология
РНК-интерференция используется в биотехнологии, в частности для создания растений, синтезирующих натуральные токсичные вещества в более низких количествах. Разработаны методы создания растений, стабильно экспрессирующих компоненты системы РНК-интерференции, например, семена хлопка в норме богаты белком, пригодным для употребления в пищу, но содержат токсичный терпеноид госсипол (англ. Шаблон:Lang-en2). Методы, использующие явление РНК-интерференции, позволяют создавать линии хлопка с пониженным уровнем ключевого для синтеза госсипола фермента — (+)-δ-кадинен-синтазы. При этом, другие части растения экспрессируют данный фермент на обычном уровне, так как госсипол является важным соединением, защищающим растения от вредителей<ref name="Sunilkumar">Шаблон:Статья</ref>. Сходные попытки принимаются для снижения уровня цианидов в натуральном продукте линамарине, получаемого из Шаблон:Bt-ruslat<ref name="Siritunga">Шаблон:Статья</ref>.
Разработаны способы снижения уровней аллергенов в растениях томата<ref name="Le_tomato">Шаблон:Статья</ref> и способы снижения предшественников канцерогенов в растениях табака<ref name="Gavilano">Шаблон:Статья</ref>. Другими примерами генно-инженерных изменений растений, является создание опийного мака со сниженным уровнем наркотических веществ<ref name="Allen">Шаблон:Статья</ref>, повышение устойчивости растений к вирусам<ref name="Zadeh">Шаблон:Статья</ref>, а также добавление в плоды томатов антиоксидантов<ref name="Niggeweg">Шаблон:Статья</ref>. Более ранние коммерческие генно-инженерные растения — томат и папайя, были разработаны с использованием антисмысловых РНК, по-видимому, работающих по механизму РНК-интерференции<ref name="Sanders">Шаблон:Статья</ref><ref name="Chiang">Шаблон:Статья</ref>. С помощью РНК-интерференции учёными Узбекистана была подавлена функция гена фитохрома А хлопчатника. В результате были получены линии хлопчатника у которых одновременно улучшены несколько важных признаков: длина и качество волокна,урожайность, время созревания, устойчивость к водному дефициту и солевому стрессу. На основе полученных линий хлопчатника были созданы новые высококачественные сорта хлопчатника серии Порлок, которые в настоящее время высеваются на полях Узбекистана. Волокно данных сортов реализуются по цене выше чем у обычного хлопчатника, так как по качественным характеристикам они превосходят волокна обычного хлопчатника<ref>Abdurakhmonov IY, Buriev ZT, Saha S, Jenkins JN, Abdukarimov A, Pepper AE. 2014. Cotton PHYA1 RNAi enhances major fiber quality and agronomic traits of cotton (Gossypium hirsutum L). Nature Communications 4:3062; DOI:10. 1038/ncomms4062</ref>.
Примечания
Литература
- Шаблон:Статья
- Шаблон:Статья
- Шаблон:Статья
- Шаблон:Статья
- Шаблон:Статья
- Шаблон:Cite web
- Шаблон:Cite web
- Шаблон:Статья
- Takashi Tsujiuchi, Andrew D. Miller, Toshihiko Wakabayashi, Atsushi Natsume (2014) RNA Interference Therapeutics for Tumor Therapy: Promising Work in Progress. In: Gene Therapy of Cancer (Third Edition), 2014, Chapter 27, Pages 393-408 Elsevier
- Advanced Delivery and Therapeutic Applications of RNAi. Ed. by Kun Cheng, Ram I. Mahato (2013) ISBN 978-1-118-61073-2
Ссылки
- Обзор РНК-интерференции от Cambridge University’s The Naked Scientists
- Анимация процесса РНК-интерференции из Nature
- Анимация процесса РНК-интерференции с русскими субтитрами и пояснениями
- NOVA scienceNOW о процессе RNAi, 15 минутное видео
- Silencing Genomes — эксперименты по РНК-интерференции в C. elegans. Центр изучения ДНК Cold Spring Harbor.
- Протокол использования РНК-интерференции в C. elegans в 96-луночном формате для изучения генетических взаимодействий
- Молекулярная терапия: Развитие РНК-интерференции в терапии, коллекция статей в открытом доступе из журнала Nature
Шаблон:Внешние ссылки Шаблон:Прорыв года (по версии журнала Science) Шаблон:Хорошая статья